杂交试验中用于降低背景的封闭剂

试剂用途denhardt试剂northern杂交使用rna探针的杂交单拷贝序列的southern杂交将dna固定于尼龙膜上的杂交denhardt试剂通常配制50×贮存液，过滤后保存于-20℃。可将该贮存液10倍稀释于预杂交液（常为含有0.5%sds和100μg/ml经变性被打断的鲑精dna的6×ssc或6×sspe）中。50×denhardt液中含5g聚蔗糖（ficoll,400型，pharmacia）、5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白（组分v”sigmal），加水至终体积为500ml。blottogrunstein-hogness杂交benton-davis杂交除单拷贝序列southern杂交以外的所有southern杂交斑点印迹1×blott（牛乳转移技术优化液，bovine lacto transfer technique optimizer）,是含5%胶脂奶粉和0.02%叠氮钠的水溶液，应保存于4℃。使用前可用预杂交液稀释25倍。blotto不应与高浓度的sds并用，因为后者会导致牛奶中蛋白质析出。如果杂交背景不合要求，可在杂交液中加入np-40至终浓度为1%。blotto不能用作northern杂交的封闭剂，因为这一封闭剂中可能含有rna酶，其活性之高使人无法接受。注意：叠氮钠有毒性，取用时需戴手套小心操作。含叠氮钠的溶液应予明确标记。肝素southern杂交原位杂交肝素（sigma h-7005，从猪中提取的二级产品或相当等级的产品）用4×sspe或4×ssc溶解配制成50mg/ml的浓度，保存于4℃。肝素在含有葡聚糖硫酸酯的杂交液中用作封闭剂的浓度为500μg/ml，在不含葡聚糖硫酸酯的杂交液中的浓度为50μg/ml。经变性并被打断的鲑精dnasouthern和northern杂交把鲑鱼精子dna（sigma,ⅲ,盐钠）溶解于水配制成10mg/ml的浓度，必要时于室温磁力搅拌2～4h助溶。把溶液中nacl的浓度调至0.1mol/l，并用酚和酚/氯仿各抽提一次，回收水相。合dna溶液快速通17号皮下注射针头12次，以剪切dna。加入2倍体积用冰预冷的乙醇沉淀dna。离心回收dna并重溶于水，配制成10mg/ml的浓度，测定溶液的od260值并计算出精确的dna浓度，然后煮沸10min，分装成小份保存于-20℃。使用前置沸水浴中加热5min，然后迅速在冰浴中骤冷。预杂交液中应含有100μg/ml经变性并被打断的鲑鱼精子dna

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